Co-IP：研究的是體內(nèi)自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)互相作用，不能顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用是直接還是間接的。

IP：根據(jù)抗原和抗體的特異性結(jié)合，利用抗體將靶標(biāo)蛋白分離或純化，檢測某一種蛋白的表達(dá)情況。

 

 

2、Co-IP簡單介紹

 

 

 

3、Co-IP 原理

ProteinA/G

ProteinA/G 能特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的 FC 片段，因此能和抗體結(jié)合捕獲復(fù)合物，而抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，目標(biāo)蛋白和相互作用的蛋白結(jié)合。

X代表復(fù)合物。

 

 

Co-IP基本原理

 

 

4、Co-IP 流程

①樣品準(zhǔn)備

 

 

②蛋白抽提

細(xì)胞裂解后互作蛋白復(fù)合物的抽提。加入適量含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min后, 于4°C， 13000rpm條件下，離心30 min，取上清，即為總蛋白樣品。

 

 

③體系孵育

 

 

④體系洗滌

 

 

⑤WB 檢測

電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→洗膜→一抗孵育→洗膜→二抗孵育→洗膜→顯影曝光

 

 

5、Co-IP結(jié)果分析

 

 

6、Co-IP 拓展

Co-IP注意事項(xiàng)：

①溫和的裂解條件

②使用明確的抗體

③使用對(duì)照抗體

 

 

 

7、Co-IP實(shí)驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)

相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然混合蛋白狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。

 

 

8、Co-IP實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)

可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果。