酵母雙雜交體系
目前酵母雙雜交文庫構建體系有兩套：
一是Invitrogen體系，采用Gateway位點特異性重組技術（Invitrogen專利）構建文庫 。
Invitrogen 體系
二是Clontech體系，酵母雙雜交文庫構建流程 （Clontech專利）
Clonetech 體系
相關應用
酵母雙雜交(yeast two hybrid) 技術是利用酵母遺傳學方法分析蛋白質之間的相互作用，已被廣泛應用于蛋白質組學、細胞信號轉導和功能基因組學等領域，已成為分子生物學研究領域的重要實驗手段。該方法建立以來，經過不斷的完善和發展，不但可以檢測已知蛋白質之間的相互作用，更重要的在于發現與已知蛋白相互作用的未知蛋白。目前已知的蛋白質相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發現的。 而文庫篩選結果直接由文庫質量的好壞所決定，構建出高質量的文庫是得到好的篩選結果的關鍵因素。
兩種體系對比：
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Clontech體系 |
Invitrogen 體系 |
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1-2ug |
350-500ug |
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RNA起始量較少，只需要較少的材料即可進行。 |
RNA起始量增大，包含物種轉錄本信息更全面 |
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無需mRNA分離 |
Invitrogen專利試劑盒進行mRNA的分離 |
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減少實驗中間環節 |
增加mRNA的分離步驟，去除RNA內非特異模板干擾，大大提高后續反轉錄實驗效率。 |
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SMART 技術 |
Invitrogen專利高效試劑盒 |
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經典技術，比較容易操作。 |
在反轉錄實驗后期無需進行15至25循環PCR擴增步驟，直接采用一步法進行cDNA合成，大大降低基因的冗余率。 |
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酶切連接或體內重組 |
Gateway 方法重組 |
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結合本公司特有的技術優化后可使大片段重組率達到95%以上，轉化后方便客戶進行QC |
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以cDNA形式轉化到酵母菌株中體內重組 |
次級文庫混合質粒直接轉化到酵母菌株中 |
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方便客戶從前期數據結果預測轉化效率，提前安排實驗方案，做好實驗準備工作 |
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20-70次 |
無限次（理論情況下） |
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Invitrogen 體系提供初級文庫質粒及次級文庫菌液，質粒，后續轉化酵母菌株后可以根據需求分裝至少100ml以上酵母工作液，一旦后期次級文庫質粒使用完畢，無需重新構建文庫，直接使用初級文庫質粒重組構建新的次級文庫，再次重新轉化酵母菌株，大大節約客戶使用成本。 |
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文庫交付標準 |
平均插入片段：400-700bp； |
平均插入片段大于1000bp； |
交付結果：
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產品名稱 |
交付形式 |
交付標準 |
運輸 |
儲存 |
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文庫構建報告電子版 |
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酵母轉化報告電子版 |
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初級文庫質粒 |
2ml凍存管（500ul） |
>80ug |
干冰 |
-80℃ |
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次級文庫菌液 |
2ml凍存管（各>1.5ml） |
20%甘油 |
干冰 |
-80℃ |
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次級文庫質粒 |
2ml凍存管（500ul） |
>80ug |
干冰 |
-80℃ |
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酵母工作液1 |
2ml管（100管，1ml/管） |
干冰 |
-80℃ |
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酵母工作液2 |
50ml管（3管，33.3ml/管） |
干冰 |
-80℃ |
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篩庫實驗涉及的全部菌液及質粒 |
各一管 |
干冰 |
-80℃ |
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項目周期
如果您不需要進行酵母轉化，我們在30個工作日內進行交付，一般公司50個工作日。
酵母雙雜交文庫質量標準：
* 文庫容量≥5*106CFU ；
* 重組率：≥95 % ；
* 插入片斷平均大于1.0 kb。
技術特色
1. 文庫既可用于酵母雙雜又可用于酵母單雜，也適用于酵母三雜。
2. 作用信號是在融合基因表達后，在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。
3. 檢測在活細胞內進行，可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。
4. 檢測的結果可以是基因表達產物的 積累效應，因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。
5. 可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建 cDNA 文庫，從而分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。
6. 可以用來比對病變組織，更快的找到突變基因或者導致變異的蛋白，找到攻克方向。
7. 可以用作大規模的蛋白篩選，在較短時間內對找到某些藥物對相關組織主要的作用蛋白，對于藥物的修飾和改進明確方向。
8. 可以反復使用，培養快捷，適合大規模篩選使用。
技術特點
1. 我們并不是簡單的按照 clontech 和 invitrogen 的說明書操作，而是結合我們長期的實驗摸索經驗，對實驗細節進行改進。
a) 對于 clontech 體系，我們能使文庫在原有基礎上片段更長，同時降低冗余。
b) 對于 invitrogen 體系，我們為了客戶后續篩庫方便，摒棄使用 invitrogen 提供的次級文庫載體，而是采用 pGADT7 改造后的載體，這樣一來，后期既可采用共轉又可采用 mating 的手段進行篩庫。我們提供的初級文庫可以當做普通 cDNA文庫使用。如果次級文庫用完可以用初級文庫再次與AD 載體重組獲得次級文庫。
2. 我們采取 clontech 體系已經為很多客戶構建過多種物種的酵母雙雜交文庫，有很多客戶都篩選到了很有價值的基因，在篩庫方面也積累了非常豐富的經驗，如果老師在篩庫方面有什么疑問都可以跟我們溝通，我們可以利用我們的資源盡力幫助老師解決問題。
3. 如果客戶想采取 invitrogen 體系或者購買 clontech 的文庫，那么客戶就需要購買相應的 BD 構建及篩庫試劑盒，這個價格并不便宜，而如果采用我們公司提供的技術服務，我們可以免費提供給客戶 BD 載體以及篩庫所需要的菌株，這樣客戶只需要購買相應的培養基就可以開展后續實驗。
重要提醒
1. 客戶拿到所有產品收到產品后及時觀察運輸干冰情況，所有產品一律-80℃保存，所有菌液不能反復凍融。
2. 客戶拿到文庫需盡快涂布相應平板進行驗證。
常見問題及解決方案
1. 如果誘餌蛋白存在自激活，該如何處理？ 該蛋白很可能帶有完整的AD區和BD區，是個完整的轉錄因子，可以將轉錄因子基因分成兩部分分別進行文庫篩選，然后重新檢測其是否自激活，但要注意切割也有可能破壞蛋白之間的相互作用。
2. 轉化效率太低怎么辦？
1) 檢測感受態細胞效率，標準操作規范。
2) 注意質粒使用量，檢查儀器狀態。
3) 重新配制新鮮培養基，并做對照轉化。
3. 如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎么辦？ 在某些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。首先重懸克隆于 1ml 的 SD/–Trp，接著將重懸液平鋪于 5 個 100-mm 的 SD/–Trp 平板，在 30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用 5ml 0.5X YPDA 刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個細胞重懸液進行正常的雜交反應。
4. 雜交效率不高，該如何處理？ 在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當對誘餌菌株進行液體培養過夜時， 應挑選大的、新鮮的克隆進行培養，經過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數。 密度應該在 1 x 109/ml。 一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又 能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進 行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。
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